1-дәріс. Генетика тұқымқуалаушылық және өзгергіштік ғылымы
жүктеу/скачать 3,92 Mb.
|
darister
Enzyme worksheet
- Бұл бет үшін навигация:
- ДНҚ РЕКОМБИНАНТТАРЫ (БУДАН ДНҚ-ЛАР)
| Кері транскриптаза – ДНҚ – плимераза тәріздес фермент. Бірақ ДНҚ-ны ДНҚ-дан емес РНҚ-дан синтездейді. РНҚ- полимеразамен салыстырғанда ол кері бағытта жұмыс істейді, яғни ДНҚ-дан РНҚ-ға емес, РНҚ-дан ДНҚ-ға. Кері транскриптаза ферментінің қалыпты сау клеткалары бар ма, және оларда ДНҚ синтезі РНҚ-да жүре ме? Бұл күмәнді сұрақ әлі толық шешілмеген. Алайда бұл фермент, эукариоттар клеткаларында оларға ДНҚ арқылы көбейетін РНҚ-сы бар вирустарды жұқтырғаннан кейін пайда болады. Бұл вирустардың геномы кері транскриптазаны кодтайды, соның көмегімен вирустың ДНҚ- үлгісі құрылады да, кейін вирустар молекулаларының РНҚ-сы синтезделеді.
ДНҚ РЕКОМБИНАНТТАРЫ (БУДАН ДНҚ-ЛАР) Генетикалық рекомбинацияның мәні – екі хромосоманың өзара гендерімен алмасуында. Екі немесе одан көп тұқым қуатын анықтауышы бар клетканың немесе организмнің пайда болуына әкеп соғатын кез келген процесті 1958 жылы Понтекорво рекомбинация деп атады. Міндетті түрде сүтқоректілердің жыныс клеткалары пайда болғанда, мейоздың барысында гомологты хромосомалар гендерімен алмасады (кросирговер – айқасу құбылысы). Осы алмасулар ұрпақтарға берілетін тұқым қуатын белгілердің араласуын түсіндіруге мүмкіндік береді. Гендер алмасуын, сондай-ақ клеткаға “бөтен” генді енгізуді генетикалық рекомбинация арқылы in vitro – организмнен тыс жасауға болады. 1972 жылы П. Бергтің лабораториясында (АҚШ, Станфорд университеті) ең бірінші рекомбинанты деп аталатын будан ДНҚ молекуласы алынды. Оның құрамына лямбда (λ) бактериофагының геномы мен S V 40 вирус геномы кірді. Организмнен тыс рекомбинация әр түрдің ДНҚ-ларын (табиғи немесе жасанды) бөліп алып, оларды бір- бірімен қоуды, содан кейін осы рекомбинантты ДНҚ-ны тірі клеткаға енгізіп, жаңа белгінің пайда болуын мысалы, ерекше белок синтезін жүргізуді көздейді. Мұндай эксперименттердің мақсаты ДНҚ-дағы белгілі бір нуклеотидтер жүйелігін ”векторға“ енгізіп, кейін клетканың ішінде жұмыс істеткізу. ДНҚ фрагментін вектормен жалғастыру төмендегідей жолдармен жеткізіледі: ректрикциялық эндонуклеазалардың қатысуымен пайда болған ДНҚ-ның жабысқақ ұщтары арқылы; ДНҚ-ның әрбір тізбегіне қосымша полинуклеотидтер фрагменттерін синтездеу (поли- А, поли- Т); Т4-лигаза ферментінің көмегімен тұқыл ұштарын жалғау. 1974 жылдан бастап рекомбинантты ДНҚ алу жұмыстары көптеп жүргізіледі. 36-суретте геннің ферменттік синтезі және оны векторлық плазмидаға "орналастыру" көрсетілген. Кері транскриптазаның көмегімен иРНҚ молекуласында ДНҚ тізбегі синтезделеді (қДНҚ)-полимеразаның көмегімен ДНҚ-ның екінші тізбегі құрылады. Экзонуклеаза ферментімен ДНҚ-ның екі тізбегі де қысқартылып, ұштық трансфераза арқылы олардың ұштарына поли –Т жүйелігі тігіледі. Векторлық плазмиданың сақина ДНҚ-сын рестриктазамен кесіп желі (сызық) түріне келтіреді, содан кейін экзонуклеазамен қысқартып, ұштық трасферазамен поли-А жүйесін тігеді. Ең ақырғы кезеңде осы ДНҚ молекуласының екі типін жалғап будан молекулалы синтезделген геномы бар векторлық плазмида алады. ДНҚ тізбегінің үзілген жерлерін лигазаның көмегімен жалғайды. Бұл баяндалған жағдайда векторлық 36-сурет. Геннің ферменттік синтезі және оның векторлық плазмидаға орналастыру. (С.М.Гершензон бойынша) плазмидаға қандай ген енгізілгені белгілі. Бірақ трансгеноз жұмыстарында көбінесе көптеген ДНҚ фрагменттері пайдалыннады, ал солардың ішінде бірлі-жарлымында ғана "керек" ген болады. Осығае байланысты ген инженериясыда қажет гені бар ДНҚ фрагменттерін табу және оны бөліп алу әдісінің маңызы өте зор. Осы керек гені бар ДНҚ бөлшегін алу үшін "бытра мылтық" деп аталатын тәсіл қолданылады.Оның мәні мында: ДНҚ ферментер арқылы көптеген ұсақ бөлшектерге бытыратылады, содан кейін соқыр тәукелмен оны вектордың ДНҚ молекуласымен будандастырылады.Осының алдында векторлық ДНҚ-ны желі түріне келтіру үшін және жабысқақ ұштар пайда болу үшін рестриктазамен өңдейді. Ішек таяқшасына рекомбинантты молекуланы кіргізгеннен соң , сұрыптайтын қоректік ортаның көмегімен қажетті гені бар ДНҚ бөлшектері түскен бактерияларды бөліп алады. Кірген генді оның шығаратын заты (фермент, гормон т.б)арұылы тауып алады. Бактериялар көбейгенде оның құрамындағы рекомбинантты ДНҚ еселенеді де ДНҚ өркендері (клондары) пайда болады. ВЕКТОРЛАР – ГЕН ТАСЫҒЫШТАР. Осы уақытқа дейін бөтен генді клетка ішіне алып баратын плазмида дедік. Сондай қызмет атқаратын ДНҚ түрлерін векторлар дейді. Вектор бағыттағыш деген мағынаны білдіреді. Векторды да қолдан құратырады және оған мынадай талаптар қойылады: вектор клетка ішіне бөтен генді алып кірген соң клеткамен бірге немесе өз алдына бөлініп көбейе алатын болуы керек, сонда ғана ол ұрпақ клеткаларға беріледі. Немесе ол ұрпақ клеткаға беріліп отыруы керек; генетикалық белгілері болуы керек, сол белгілер бойынша оның қайтадан клетка ішіне енгенін анықтайды; Құрамында рестриктазалар тауып үзе нуклеотидтер тізбегі болуы керек және рестриктазамен бір реет үзіліп жалғанғаннан кейін ол репликацияланатын (еселенетін) қабілетін (репликация нүктесін) жоғалтпауы тиіс; Құрамыеа кірген геннің клетка ішінде дұрыс реттеліп жұмыс істеуін қамтамасыз ететін болуы керек; Оның клетка ішіндегі көшірмесі (молекулаларының саны) жетерліктей көп болуы қажет. Қолымызда геннің аз мөлшері бар дедік. Геннің ондай мөлшерімен тәжірибе жасау өте қиын . Сондықтан әлгі генді көп мөлшерге дейін көбитуге тура келеді. Ол үшін геннің аз мөлшерін вектормен бірге бактерия клеткасына ендіреді. Бактерияның тез бөлініп көбеюімен бірге оның ішіндегі ілгі ген бар вектор да көбейеді. Ақырында көп масаға дейін өсірілген бактериядан генді қажетті мөлшерде қайта бөліп алуға болады. Бактерия клеткасына генді енгізу үшін вектор ретінде өзінің плазмидасы, кейде олардың фагының ДНҚ-сы қолданылады. Плазмида клетка хромосомындағы ДНҚ-ға тәуелсіз болады, өзінше бөлініп көбейе алады және оның клеткадағы көшірмесі 20 – ға дейін жетеді. Ал ерекше жағдай жасап өсіргенде векторлардың көшірмесін тіптен мыңға дейін жеткізуге болады. Лямбда фагының негізінде фагтық векторды 1974 жылы Эдинбург университетінде Н. Муррей және К. Муррей ашты. Осыдан жарты жыл кейін Тихомиров т.б. ССРО-да λ – векторды алды. Эукариоттар вирусынан вектор ретінде онкогендік вирус S V 40 қана қолданылады. жүктеу/скачать 3,92 Mb. Достарыңызбен бөлісу:
|