ПЦР. Полимеразды тізбекті реакция. ДНҚ клондау әдісі. ДНҚ секвенирлеу әдісі. Электрофоретикалық әдіс.
Тұқым қуалайтын материалды (нуклеин қышқылдары) зерттеу әдістері үнемі жетілдіріліп отырғанына қарамастан, ДНҚ құрылымын талдау үшін жасушалық материалдың белгілі бір мөлшері қажет болды. Мысалы, саусақ ізі сияқты сезімтал әдісті пайдаланған кезде де талдау үшін жасушаларда ДНҚ-ның жеткілікті көшірмелері бар жануар немесе өсімдік тінінің үлгісінің бір тамшы қаны немесе басқа баламалы мөлшері болуы талап етіледі.
Полимеразды тізбекті реакция (ПТР)-бұл ДНҚ-ның белгілі бір аймағын қолданып, көптеген (миллион немесе миллиард) көшірме жасалатын кең таралған зертханалық әдіс. ПТР-ның мақсаты - мақсатты ДНҚ аймағын қажетті мөлшерін алып, оны талдауға немесе басқа тәсілмен қолдануға болады.
Кэри Муллис жасаған әдістің пайда болуының арқасында жағдай түбегейлі өзгерді. Бұл әдіс полимеразды тізбекті реакция (ПТР) деп аталады және әлемдегі барлық гендік инженерия зертханаларында игерілген интегралды процедураға айналды.
ПТР әдісін қолдану бірнеше сағат ішінде көшірмелер санын миллиондаған есе арттыра отырып, ДНҚ немесе оның фрагментін in vitro күшейтуге (көбейтуге) мүмкіндік береді.
ПТР пробиркада арнайы термотұрақты фермент ДНҚ-полимераза (Таг полимераза), барлық төрт нуклеотидтер A, T, Г және Ц жиынтығы және қысқа олигонуклеотидті праймерлер – праймерлер көмегімен жүзеге асырылады.
Әрбір ПТР реакциясына екі праймерпайдаланылады, олардың құрылымы сондай мақсатты аймақтың (көшіріліп алынатын аймақ) екі ұшынан қаптайды.
Яғни, оларға қарама-қарсы тізбек ДНҚ-матрицамен байланыстыру үшін ұсынылған реттілік көшірмесі аймақтың шетінен басталады.
Праймерлер қосымша нуклеотидтерді ДНҚ үлгісімен жұптастыру арқылы байланыстырады.
Праймерлер- қысқа, ұзындығы 20-30 нуклеотидті, көшірілген ДНҚ шаблонының 3'-терминалды тізбегіне комплементарлы бір тізбекті ДНҚ фрагменттері.
Праймерлер праймерлердің 3' ұштарына бекітілетін және оларды алдын ала белгіленген ұзындыққа дейін аяқтайтын Tag-DNA полимераза арқылы көшірілетін ДНҚ фрагментін шектейді.
Полимеразды тізбекті реакция (ПТР) үш кезеңде жүреді.
Денатурация.
Қажетті ДНҚ үлгісін қамтитын инкубациялық қоспасы 90°C температураға дейін қызады. Бұл жағдайда 15 секунд ішінде ДНҚ тізбектері арасындағы әлсіз сутектік байланыстар жойылып, бір қос тізбекті молекуладан екі бір тізбекті молекула түзіледі.
