Алматы-2020 Қазақ Республикасының Білім және Ғылым Министрлігі
жүктеу/скачать 2,78 Mb. Pdf көрінісі
|
Жүнісжан А.Ж.-6
49, 5-апÑа ХимиÑлÑÒ Ð±Ð°Ð¹Ð»Ð°Ð½ÑÑ
- Бұл бет үшін навигация:
- Кері транскрипция реакциясы бар нақты уақыттық ПТР
- Реал-Тайм ПТР
| ПТР жүргізетін шарттар
• Биологиялық материалдарды дайындау • ПТР қою • Нәтижелерді талдау Кері транскрипция арқылы жүретін ПТР (RT-PCR) Кері транскрипция арқылы жүретін ПТР (RT-PCR) – геномы РНҚ молекуласынан тұратын организмдерді зерттеуде кеңінен қолданылады. Бірінші кезеңде аРНК молекуласын матрица ретінде қолдана отырып ревертаза (кері транскриптаза) ферменті арқылы біртізбекті ДНҚ молекуласын синтездейді. Бұл синтезделген ДНҚ молекуласы келесі реттегі реакцияға қолданылады. Ол үшін екі вирустан бөлініп алынған кері транскриптаза ферменттерін қолданылады. Бұл ревертазаларды қолдану бірнеше қиындықтарды тудырады. Біріншіден оларжоғары температурада төзімсіз, яғни 42˚ жоғары температурада жоғары белсенділігі төмендейді. ● ПТР жүргізу. “Ыстық” нүктеден басталатын ПТР (hot-start PCR) – праймерлердің арнайы жабысуына қажетті температураға дейін ДНҚ полимераза ферментінің белсенділігін бастай отырып жүргізілетін ПТР әдісінің жетілдірілген түрі. Кері транскрипция реакциясы бар нақты уақыттық ПТР Нақты уақыт ішінде стандартты ПТР жүргізу алдында ДНҚ синтезі үшін кері транскрипция реакциясын жүргізу керек. Кері транскрипция реакциясы керітранскриптазатпен ферментіменорындалады. Реакцияны праймерді қоспай, жүзеге асыруға болады, алайда, праймер қосылған кезде ең үлкен тиімділікке қол жеткізіледі. Праймерлердің үш негізгі түрі бар: 1. Олиго dT праймеры 2. Кездейсоқ жүйе. Әдетте, немесе гексамер немесе нонамер пайдаланылады. 3. Ген-спецификалық праймер, мРНК зерттеу үшін қолданылады. Реал-Тайм ПТР Молекулярлық биологияда реал-тайм ПТР (немесе сандық ПТР, нақты уақыттық ПТР, qPCR, qRT-ПТР) - бір мезгілде берілген ДНҚ молекуласының мөлшерін өлшеу үшін полимеразды тізбекті реакция әдісіне негізделген зертханалық әдіс.. Бұл әдіс ПТР-дың жалпы принциптерінде қолданады. Негізгі айырмашылығы, амплификацияланғаннан кейін ДНҚ көлемі нақты уақытта өлшенеді. Сандық көрсеткішті анықтау үшін екі әдіс қолданылады: екі еселенген ДНҚ молекулаларымен араласқан флуоресцентті бояғыштар, гибридизациядан кейінДНҚ-ның комплементарлы учаскілерімен флуоресценцияланатын модификацияланған олигонуклеотидтер. Жиі нақты уақыттық ПТР КР-ПТР (кері транскрипция) сәйкестендіріледі,бұл аз мөлшерде мРНҚ көлемін өлшеу үшін, зерттеушіге жасушада осы мРНК мазмұны туралы сандық ақпаратты және генэкспрессиясы туралы ақпарат алуға мүмкіндік береді. |